Exp Hematol Oncol.｜复旦大学附属中山医院詹成团队揭示：肌氨酸双重机制激活铁死亡，增强肺腺癌顺铂敏感

英文标题：Sarcosine sensitizes lung adenocarcinoma to chemotherapy by dual activation of ferroptosis via PDK4/PDHA1 signaling and NMDAR-mediated iron export

中文标题：肌氨酸通过PDK4/PDHA1信号通路双重激活铁死亡及NMDAR介导的铁输出使肺腺癌对化疗敏感

发表期刊：Experimental hematology & oncology

影响因子：9.4

客户单位：复旦大学附属中山医院

百趣提供服务：非靶标代谢流

研究背景

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中肺腺癌(Lung Adenocarcinoma, LUAD)是非小细胞肺癌中最常见的亚型，尽管治疗手段不断进步，其五年生存率仍不足26%，化疗耐药是导致预后不良的关键因素之一。铁死亡作为一种铁依赖的脂质过氧化程序性细胞死亡方式，因其能克服传统治疗耐药性而成为研究热点。越来越多证据表明，调控铁死亡可增强肿瘤对化疗的敏感性，但如何精准诱导铁死亡并阐明其代谢调控机制仍不明确。肌氨酸作为内源性代谢物，在前列腺癌等肿瘤中与侵袭转移相关，但其在LUAD中的作用未知。本研究通过代谢组学筛选发现肌氨酸显著增强LUAD细胞对铁死亡诱导剂(Ferroptosis Inducers, FINs)的敏感性。结合临床数据与机制研究，证实肌氨酸通过双重机制调控铁死亡。此外，肌氨酸与顺铂联用可协同增强化疗敏感性，且临床样本中高肌氨酸水平与患者预后改善相关。本研究填补了肌氨酸在铁死亡和LUAD中作用的空白，为克服化疗耐药提供了新靶点，其安全性和代谢调控特性使其有望成为铂类化疗的潜在佐剂，具有重要临床转化价值。

1、代谢物文库筛选揭示肌氨酸增强LUAD细胞铁死亡敏感性

为筛选调控铁死亡的关键代谢物，并验证肌氨酸是否通过特定机制增强LUAD细胞对铁死亡的敏感性，研究首先对铁死亡诱导剂RSL3处理的LUAD细胞系（A549和PC9）进行非靶代谢组学分析，发现肌氨酸显著下调等独特代谢特征（图1A-B）。随后在RSL3诱导的铁死亡模型中，利用包含889种人类内源性代谢物的文库进行筛选，确定肌氨酸为RSL3介导铁死亡的强效增强剂（图1C-D）。

细胞毒性实验显示，肌氨酸与铁死亡诱导剂（如RSL3、IKE）联用可显著降低细胞活力，且该协同效应可被铁死亡抑制剂[脂质过氧化清除剂(Ferrostatin-1, Fer-1)、铁螯合剂(Deferoxamine, DFO)]完全消除，但不受凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)或坏死性凋亡抑制剂(Necrosulfonamide)影响，确认肌氨酸促铁死亡作用的特异性（图1E–H）。进一步检测显示，外源性肌氨酸显著增强RSL3诱导的脂质活性氧(Lipid-ROS)生成（图1I）、胞内亚铁离子积累（图1J）和丙二醛(MDA)水平升高（图1K）。透射电镜观察到肌氨酸处理后细胞线粒体嵴消失、体积缩小等铁死亡特征性超微结构改变（图1L）。

综上，肌氨酸通过增强铁依赖的脂质过氧化和线粒体功能紊乱，显著提升LUAD细胞对铁死亡的敏感性。

2、肌氨酸通过代谢重编程增强铁死亡敏感性

为探究肌氨酸调控铁死亡的机制，首先采用¹⁵N-肌氨酸同位素追踪代谢流分析，发现肌氨酸在LUAD细胞中极少转化为甘氨酸等下游代谢物（图2A）。使用透析血清（去除小分子物质）培养细胞后，细胞内肌氨酸几乎不可检测，证实其主要来源于培养基血清，而非细胞从头合成。这一结果排除了肌氨酸通过甘氨酸代谢（如谷胱甘肽合成）发挥作用的可能。

进一步通过非靶代谢组学分析发现，肌氨酸处理后，丙酮酸水平显著降低，柠檬酸水平显著升高，差异代谢物显著富集于三羧酸循环(TCA cycle)通路（图2B-C）。Seahorse能量代谢检测显示，肌氨酸诱导细胞外酸化率(Extracellular Acidification Rate, ECAR)降低、耗氧率(Oxygen Consumption Rate, OCR)升高，证实代谢模式从糖酵解向氧化磷酸化转变（图2D）。活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)检测显示，肌氨酸处理组总 ROS 和线粒体 ROS 荧光强度显著增加，提示线粒体电子传递链电子泄漏增加，导致超氧阴离子生成增多（图2E-F）。此外，通过丙酮酸脱氢酶(PDH)活性检测发现，肌氨酸可显著激活PDH，推动代谢通量进入TCA循环。

综上，肌氨酸通过外源补充直接激活PDH，重塑代谢通路为氧化磷酸化模式，增强线粒体ROS爆发并打破氧化还原平衡，从而特异性提升LUAD细胞对铁死亡的敏感性。该效应不依赖于肌氨酸的代谢转化（如代谢为甘氨酸），而是通过调控代谢流实现。

3、肌氨酸通过抑制PDK4激活三羧酸循环

为探究肌氨酸诱导代谢转向氧化磷酸化并增强铁死亡敏感性的机制，研究发现肌氨酸可显著激活丙酮酸脱氢酶(Pyruvate Dehydrogenase, PDH)活性（图3A），并降低PDHA1（PDH复合物E1α亚基）S293 位点磷酸化水平（图3B）。分子对接实验显示，肌氨酸与PDK4的BCDHK_Adom3结构域特异性结合（图3C）。

通过CRISPR/Cas9技术构建PDK4敲除(PDK4-KO)细胞及BCDHK_Adom3结构域突变体（ΔAdom3，删除 Asp118、Asp182、Ser183），发现PDK4缺失或BCDHK_Adom3结构域突变完全消除了肌氨酸对PDH活性的激活作用（图3D）和PDHA1磷酸化的抑制效应（图3E）。进一步检测显示，PDK4-KO细胞的线粒体ROS(Mito-ROS)水平在肌氨酸处理后显著低于野生型细胞（图3F-G），且对FINs(RSL3/IKE)的敏感性显著增强（图3H-I）。

综上，肌氨酸通过直接结合PDK4的BCDHK_Adom3结构域，抑制其对PDHA1的磷酸化作用，从而激活PDH并推动代谢通量进入三羧酸循环。PDK4抑制是肌氨酸通过代谢重编程增强铁死亡的核心分子机制。

4、肌氨酸激活NMDAR/MXD3信号通路以调控SLC40A1

为探究肌氨酸是否通过N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)信号通路调控铁死亡及其分子机制，研究发现肌氨酸处理显著下调亚铁离子输出跨膜蛋白SLC40A1的表达（图4A）。DEPMAP数据显示，LUAD细胞中SLC40A1表达与肌氨酸丰度呈负相关（图4B）。功能实验表明，肌氨酸可升高细胞内亚铁离子水平（可被DFO逆转），并负调控SLC40A1蛋白表达，而NMDAR拮抗剂MK-801则显著逆转这一效应（图4C-E）。

转录组学分析进一步筛选出HLX、HSF4、MXD3和SCX为差异最显著的转录因子（图4F）。聚焦MXD3发现，其在LUAD中与SLC40A1表达呈负相关（图4G）。构建MXD3敲低/过表达细胞系证实，MXD3缺失可显著上调SLC40A1（图4H-I），而免疫组化显示，LUAD组织中MXD3与SLC40A1表达负相关，与脂质过氧化标志物4-HNE正相关（图4J-K）。ChIP-qPCR证实MXD3直接结合于SLC40A1启动子区域（图4L），荧光素酶报告基因实验进一步显示，MXD3可抑制SLC40A1野生型启动子活性（图4M）。

综上，肌氨酸通过激活NMDAR，诱导MXD3介导的SLC40A1转录抑制，减少铁输出并导致细胞内铁蓄积，从而增强LUAD细胞对铁死亡的敏感性。

5、PDK4激活和NMDAR阻断逆转肌氨酸介导的铁死亡

为研究PDK4和NMDAR对肌氨酸诱导铁死亡的调节作用，通过构建过表达PDK4的LUAD细胞系（图5A-B）并结合NMDAR药理学抑制实验，发现PDK4异位表达与NMDAR拮抗剂MK-801联用(10 µM)，可显著减弱肌氨酸的促铁死亡效应。具体表现为：肌氨酸联合RSL3/IKE诱导的脂质活性氧水平显著降低（图5D），且细胞对铁死亡诱导剂的敏感性降低（图5C）。

综上，PDK4激活与NMDAR阻断可协同逆转肌氨酸介导的铁死亡，揭示两者在肌氨酸调控铁死亡通路中的关键作用（图5C-D）。

6、肌氨酸通过铁死亡增强CDDP敏感性

为探究肌氨酸是否通过铁死亡途径增强LUAD对顺铂(Cisplatin, CDDP)化疗的敏感性，并验证其临床相关性，研究在LUAD细胞中添加外源性肌氨酸并联合CDDP处理，发现肌氨酸可显著提高细胞对CDDP的敏感性，且该效应能被铁死亡抑制剂(Fer-1、DFO)削弱，证实其依赖铁死亡途径（图6A-C）。单细胞测序分析显示，NMDAR亚基编码基因(GRIN1、GRIN2D)在肿瘤细胞中优先表达，提示肌氨酸作用的肿瘤特异性（图6D-G）。

临床样本分析显示，在120例LUAD患者中，高肌氨酸水平组总生存期(OS)显著优于低肌氨酸水平组（图6H）；在41例接受CDDP化疗的亚组中，高肌氨酸水平患者OS呈改善趋势（图6I），且血清肌氨酸水平与OS呈正相关。综上所述，这些数据强调了肌氨酸在增强顺铂疗效和改善LUAD患者预后中的治疗潜力。

7、肌氨酸在患者来源PDOs和异种移植模型中增强治疗效果

为在临床前模型中验证肌氨酸增强铁死亡及化疗敏感性的机制，研究通过慢病毒转染构建PDK4过表达的LUAD类器官(Patient-Derived Organoids, PDOs)模型。形态学观察显示，肌氨酸处理导致PDOs萎缩，ATP酶活性检测证实其代谢活性降低（图7A-B），且对铁死亡诱导剂(FINs)和顺铂(CDDP)的敏感性显著提升（图7C）。NMDAR拮抗剂MK-801处理可显著消除肌氨酸的增敏作用（图7D-E）。

在体内异种移植模型中，对照荷瘤小鼠(Ctrl)接受IKE(40 mg/kg)、CDDP(3 mg/kg)联合肌氨酸（2 mM饮水）治疗时，肿瘤生长显著抑制（图7G-I），而PDK4过表达肿瘤或MK-801处理组中肌氨酸的增强效应消失。多重免疫组织化学(mIHC)分析显示，肌氨酸治疗组肿瘤组织中脂质过氧化标志物4-HNE显著升高，而PDK4过表达或MK-801处理可逆转这一效应（图7J）。

综上，肌氨酸通过依赖PDK4抑制和NMDAR激活的双重机制增强铁死亡和化疗敏感性，在克服LUAD治疗耐药性方面展现出显著治疗潜力。

本研究发现肌氨酸可通过双重机制增强肺腺癌(LUAD)细胞对铁死亡和化疗的敏感性：一方面，肌氨酸结合PDK4抑制其活性，激活丙酮酸脱氢酶(PDH)推动代谢转向氧化磷酸化，增加线粒体活性氧(ROS)生成；另一方面，作为NMDAR共激活剂，肌氨酸通过MXD3抑制铁输出蛋白SLC40A1转录，导致细胞内铁蓄积，协同诱导铁死亡。在细胞模型、患者来源类器官(PDOs)及异种移植模型中，肌氨酸均显著增强顺铂化疗效果，且临床样本显示其水平与患者总生存期正相关，提示肌氨酸有望成为LUAD治疗的潜在辅助药物。